1.かっちりとしていなかったtRNA遺伝子

地球上の生きものは多種多様であり、一見、生物が暮らせそうにない100℃近くの温泉や塩湖、深海などの環境にも、古細菌などの単細胞の微生物群が存在していることが最近わかってきた。古細菌とは1990年に提唱されたバクテリアにも真核生物にも属さない第３の生物界で、全生物の共通祖先に近い形質を今も残していると言われている。

DNAの情報がメッセンジャーRNA(mRNA)に転写され、転移RNA(tRNA)（註1）を介した翻訳によってタンパク質ができるという生物共通のしくみは、古細菌にも通用する。このしくみの中でtRNAは、自身がRNA分子でありながら、タンパク質合成に必須なので、初期の生命システムから現在までとぎれることなく存在している分子化石と考えられてきた。ところが、近年の古細菌のゲノム解析により、一部のtRNA遺伝子が大きく異なることがわかってきた。通常、tRNA遺伝子は転写後にすぐ三つ葉の形をしたクローバー葉構造をとるようになっている。ところが、古細菌では、tRNAになる前に切りとられるイントロンという領域があったり、tRNAが２つの断片に分かれて存在したりする (split tRNA)のである（図1）。

実は、split tRNAが発見されたナノアーキア（Nanoarchaeum equitans）は他の古細菌に寄生して暮らすので、一般の古細菌よりもゲノムがかなり縮小しており、大規模な再編成が生じた痕跡も残っている。つまり、split tRNAは変わった古細菌に偶然できた遺伝子である可能性も否定できない。私たちはさまざまな古細菌のtRNA遺伝子を調べ、その起源と進化を探ることにした。
 

2.新たなtRNA遺伝子を探す

最初の関門はtRNA遺伝子の探索方法である。従来のソフトウェアは一般的なひとつながりのtRNA遺伝子の探索を想定しているため、断片化したtRNA遺伝子を予測できない。そこで、私たちは独自にゲノムの異なる領域をつなぎあわせてtRNA遺伝子を探す「SPLITS」（註2）というソフトウェアを開発した。まず、４６種あるはずのtRNA遺伝子の一部が見つかっていない古細菌を数種選び出し、ゲノムの中に隠れているtRNA遺伝子を洗い出した。すると、イントロンを複数持つようなtRNA遺伝子が見つかってきたが、断片化したsplit tRNA遺伝子は１つも見つからなかった。やはりナノアーキアのsplit tRNAは寄生性の古細菌だからこその特別な形なのだろうかという思いも頭をよぎったが、さらに多くの古細菌のゲノムを解析した。その過程で、２００７年末にゲノムの塩基配列が公開されたカルディヴィルガ（註3）という超好熱好酸性古細菌では、グリシンに対応する全３種（CCC/TCC/GCC）、アラニンに対応する２種（CGC/TGC）グルタミン酸に対応する１種（TTC）の計６種のアンチコドンを含むtRNA遺伝子が未発見であることがわかった。これほど多種のtRNAが見つからなかった例はsplit tRNA遺伝子をもつナノアーキア以外では初めてのことなので、新しいsplit tRNA発見へ期待が一気に高まった。

SPLITSを使うと、予想通り、グリシンのtRNA遺伝子が１つ、アラニンのtRNA遺伝子が２つ、グルタミン酸のtRNA遺伝子１つの合計４つがsplit tRNA遺伝子として見つかった。ところが、グリシンに対応する残り２つのtRNAがどうしても見つからない。そこで、カルディヴィルガの近縁種のtRNA遺伝子を断片化し、その配列を用いて検索したところ、カルディヴィルガのゲノムからグリシンのtRNAの前半３分の１とそっくりな配列が見つかった。実はこのtRNA遺伝子の後半部分は先の解析でsplit tRNAとして発見されていたので、前半の３分の１と後半の配列の間をつなぐような、アンチコドンを含む第３の断片があるはずだと考えた。

そこで一工夫し、前半の３分の１をコードするtRNA遺伝子断片の、のりしろとなるリーダー配列に対して相補的な配列を加えて検索すると、カルディヴィルガのゲノムに候補となる配列が２つあることがわかった。驚いたことに、それはわずか１２塩基のtRNA配列であり、両側にはのりしろとなるリーダー配列がついていたのである。こうして小さな第３の断片が発見できた。tRNA遺伝子が３つに分かれていた上に、こんなに短い配列だったので、なかなか見つからなかったのも当然だ。私たちは今回発見したグリシンのtRNA遺伝子を"3つに分かれている"という意味で「Tri-split tRNA」と名付けた。

これで、カルディヴィルガからは全部で１０のtRNA遺伝子断片が見つかった。ところが、これだけでは６種のtRNA遺伝子をつくるには、足りないのである。どうやって機能するtRNAを作り出しているのだろうか。遺伝子断片どうしの結合を確かめるシミュレーションを行うと、tRNAの前半や後半の断片を共有し 、アンチコドンを含む残りの断片を組み換えて異なるtRNAをつくっていることが明らかになった（図2）。まさに遺伝子のジグソーパズルである。

3.はたらくことのできるtRNAなのか

ここまではシミュレーションで進めてきたが、２つや３つに断片化されたtRNA遺伝子が細胞内で本当にはたらいてtRNAをつくっているのかということを確かめる必要がある。まず、tRNA断片が細胞内で存在することを確認し（図3）、それぞれの断片の塩基配列を解読すると、今回発見した10のtRNA断片が全て存在することがわかった。さらに、10のtRNA遺伝子断片の組み合わせでできあがる6種類の成熟tRNAが細胞内に実在することもわかった。Tri-split tRNAに関しては３つの断片のうち２つがつながった２種類の中間体が細胞内に実在することが実験で証明できた（図4）。Tri-split tRNAを作り上げるための明確な順序はなく、３つに分かれた断片が偶然に出会った順にくっついていくようである。

残る問題は断片どうしがつながったtRNA分子がタンパク質の合成に使われているかどうかである。私たちはカルディヴィルガのtRNAにグリシンを付加する酵素を精製し、グリシンに対応するTri-split tRNAやsplit tRNAと試験管内で反応させたところ、実際tRNAにグリシンが付加することを確認できた。断片の組み合わせから生じたtRNAはタンパク質合成に用いることができる形になっていたのである。

4.tRNA遺伝子の原型を考える

細胞内で２つや３つに分かれたtRNAの断片は必ず出会えるという保証はなく、いくつかのtRNAで共有しているtRNA断片は先に出会ったものどうしでくっついてしまうという、早い者勝ちの原理がはたらく。それぞれのtRNA断片が無事に成熟したtRNAになれるようにするには、細胞内で発現するtRNA断片の量をうまく調節する必要がある。さもないと、特定のtRNAの生産量が追いつかず、タンパク質合成が滞ってしまう場合もあるだろう。このように断片化した遺伝子をつなぎ合わせるというしくみは、非効率な面があるが、一方、断片を組み換えることによって新たな機能を生む利点もある。カルディヴィルガは古細菌の系統樹の根元に近い位置から分岐しているので、原始的な遺伝子の構造を残していてもおかしくはない。短いRNA断片を組み合わせる試行錯誤が長いtRNA遺伝子の原型となり、ゲノムに固定されたと考えることができそうに思う。

私たちは時間を戻すことはできないが、初期の生命システムの痕跡を自然界から探すことは可能である。今後は、split tRNAが本当に初期の生命系の形質を残したものであるのかを確かめるために、深海や地中深くに生息する古細菌の解析を考えている。中には１年に１度分裂する程度で、進化速度も遅いと考えられている種もある。これらは培養困難だが、今では１細胞でのゲノムDNAの解読も可能となってきたので、新たなsplit tRNAや、あるいは全く違うタイプの遺伝子が見つかるかもしれない。これらの生きものの中に、生命システムの起源や進化モデルにあてはまる痕跡が残っている可能性を考えるだけでもワクワクする。