形態形成研究室

体幹部オーガナイザーは胞胚腔の屋根の部分に形成され、覆いかぶせ運動により植物極方向に降りてくる。頭部オーガナイザーは内胚葉性の領域に形成され 体幹部オーガナイザーに押しのけられる形で予定頭部領域に移動する。

　シュペーマンらによる原口背唇部の移植実験では、移植された胚の腹側に頭部から尾部までの組織をもつ二次胚が誘導されるという結果となった(Spemann and Mangold 1924)。しかし、少なくともツメガエルにおいては上述したように初期原腸胚では原腸形成運動により刻一刻と細胞の位置や性質が変化していると考えられる。そのため、移植のための組織を切り出す、または組織を移植するタイミングによって、誘導される組織は変わる。また、オーガナイザーは一様な活性をもった組織ではないので、背側帯域の中でも取り出す部位を細分化することで、移植片のもつ誘導活性は異なってくる。そこで、イモリとツメガエルそれぞれについて、移植片と移植の結果誘導される組織の関係を詳細に調べ、オーガナイザーのもつ誘導活性の時間的変化や領域による違いを明らかにする実験を遂行した。まず、ステージ10.25のツメガエル胚からオーガナイザーを含む背側帯域を切り出し、同じくステージ10.25の別の胚の腹側帯域へと移植した。その結果、頭部組織（目、セメント腺）と体軸の誘導が観察された。これは過去に報告されたイモリやツメガエルによる原口背唇部の移植実験と一致する結果である（Spemann and Mangold 1924、De Robertis and Kuroda 2004）。次に、背側帯域を動物-植物極の軸に対して垂直に二つの部位に分け、それぞれの領域を別の胚の腹側帯域へと移植することで、部位の違いによる誘導活性の違いを調べた。これまで報告されている遺伝子発現のパターンから、動物極側の移植片では、cerberus（Bouwmeester et. al., 1996）やdkk1などが発現しており、これらの因子は頭部神経の誘導に関わるとされている。一方、植物極側の移植片では、chordinやnoggin（Smith and Harland 1992）などが発現しており、後脳や脊髄を誘導する活性をもつ。これらのことから、動物極側の移植片からは頭部が、植物極側の移植片からは体軸が誘導されると考えられた。移植実験の結果、それぞれ予想される組織が誘導されている胚が多く観察されたが、頭部と体軸の誘導を明確に分けることは現時点でできていない。考えられる理由としては、原口が入る瞬間のステージ10からステージ10.25の間で、細胞はダイナミックに移動しており、chordinやdkk1を発現している細胞群もまたその位置を変えていると考えられる。ステージ10.25の胚を厳密に見極めることが難しく、頭部と体幹部の誘導活性をもつ領域を移植片で分けることができていないものと思われる。実際に、オーガナイザー移植実験の文献等を読むとイモリとツメガエルの違いを目の当たりにする。これがオーガナイザー自体の活性の違いに起因するものなのか、それとも移植される胚の問題なのかについてはこれから解析を進めたい。発生の時間が著しく異なる為に実現可能性は低いだろうが、イモリとツメガエルにおいて互いのオーガナイザー領域を異種間移植することで、なにか新しい事が分かる事を期待している。
　次に、イモリの胚発生過程を正確に解析する為に、発生のタイムテーブル作成や移植実験の再現性の確認、背腹軸を人為的に決定する実験、さらにはin situ ハイブリダイゼーション法の検討など様々な実験を行なった。個々の結果の詳細については予備実験の域を出ないので述べる事はしないが、一例として、発生のタイムコース作成について紹介する。実験としては発生過程を同調させる為に体外受精法を用い、その後の発生をタイムラプス撮影により記録した。すると、受精後から第二分裂までの時間に無視できない相違が見られたが、その後の発生は比較的同じ早さで進む事が分かった。これは、発生が始まれば卵割自体の早さに違いはないが、発生が始まるところに数時間単位での相違が起こる事を意味する。実際にイモリではツメガエルと比較して発生の速度が極めて遅く、また原腸形成運動の進行過程が外部形態から判別しにくいことから、正確な時間を用いた記載が必要であると考えるので、発生過程をどのように同調させることができるのかについてはさらに検討すべきであろう。
　ツメガエルとは異なり、イモリの遺伝子はその配列が未知のものも多く、そのため、イモリに関しての遺伝子発現の解析や顕微注入による遺伝子の異所的発現・機能阻害といった分子生物学的実験はあまり行なわれていない。原腸形成運動をイモリとツメガエルで比較するためには、原腸形成運動に関わる因子の発現や機能を調べたり、種々の組織マーカーで細胞の動きを追うなどの解析が必要となってくる。そこで、イモリ初期胚のcDNAライブラリーを作製することで、解析に必要と考えられる遺伝子を網羅的に単離することを進めている。イモリのcDNA配列を同定した後は、オーガナイザー関連因子や、頭部などの神経や中胚葉組織特異的に発現する遺伝子などの原腸形成の過程で重要となる遺伝子について、in situ hybridization法によりその発現パターンの変化を調べることで、ツメガエルで明らかにした頭部オーガナイザーや体幹部オーガナイザーが形成される仕組みを知る事が可能になると同時に、イモリにおける神経誘導の時期と場所なども明らかとできる。実際に、ツメガエルでは初期原腸胚で神経堤に発現が始まる遺伝子の相同遺伝子であると思われるイモリ遺伝子を用いてin situハイブリダイゼーション法を行なったところ、後期原腸胚になるまでその発現が見られなかった。これは、ツメガエルでは初期原腸胚で予定神経外胚葉に中軸中胚葉が裏打ちを完了しているのに対して、イモリでは後期原腸胚まで予定神経外胚葉に中軸中胚葉が裏打ちを完了できないために神経誘導の時期が遅れている事を示しているのかもしれない。今後さらにイモリの遺伝子の発現を解析する事で、ツメガエルとの相違点が多く見いだせる事が期待できる。また、cDNAの配列を元にmRNAの合成やモルフォリノアンチセンスオリゴの設計を行い、イモリ胚へ導入し、遺伝子の機能解析を行なっていくことも可能となるが、現時点ではイモリ胚へDNAやRNAを顕微注入する方法は確立されていないので、今後その実験法も確立しなければならない。

（２）初期発生におけるミトコンドリアタンパク質UCP2の発現パターンと神経発生における役割

　脊椎動物の脳は終脳・間脳・中脳・後脳といった領域に分かれているが、これらは脳の構造ができる前の発生の非常に初期の段階（初期原腸胚）でおおまかに決定されている。この領域の決定にはさまざまな転写因子が関わっており、それらが領域特異的にカスケードをつくることで各領域が特徴づけられる。このことから脳の領域決定においては転写因子が各領域のマーカー遺伝子として非常によく研究されている。(Sasai, 2001; Wigle and Eisenstat, 2008)
　ミトコンドリア内膜タンパク質であるUCP2（uncoupling protein 2）はATP産生や活性酸素種の産生を抑制的に調節することなどが知られており(Negre-Salvayre et al., 1997) 、これまで主に哺乳類の成体や培養細胞におけるエネルギー代謝およびそれに派生する細胞の機能に関わる研究がなされてきた(Joseph et al., 2004; Yamada et al., 2006; Barnstable, 2009)。また、ATP分解酵素であるNTPDase2や、ADPが結合する受容体P2Y1が眼の形成に関わることも示されており(Masse et al., 2007)、脳・神経領域の発生においてATPが単なるエネルギー源以外にも重要な因子になっていると考えられる。
　将来中枢神経となる組織が形成される初期神経胚で、神経領域の中でも特に予定後脳の第３・第４・第５分節および将来眼となる領域にUCP2の強い発現が見られた。さらに初期尾芽胚では予定後脳の第７分節で強い発現が見られるようになり、その後の発生ステージでは、中枢神経および眼のほかに鰓弓の周辺・体節などさまざまな組織で発現が見られた。オタマジャクシの脳では、終脳（大脳）・間脳の一部および後脳の各分節での発現が見られたことから、神経の領域決定、あるいは決定を受けた後にその領域特異的になんらかの機能している事が予想される。
　アンチセンスモルフォリノオリゴ（MO）を用いてUCP2を機能阻害した後in situ hybridization法により神経領域および神経堤のマーカー遺伝子の発現を観察すると、以下の結果が得られた。

　UCP2の機能自体が未だ全体として明らかになっていない。今回の結果がどのような機序で起こったのかを解析することで成体や培養細胞を用いた研究とは違った面からUCP2の機能を解明できると期待している。

（３）神経堤とプラコード形成を制御する機構について

　私たちはこれまでに、脊椎動物を規定するともいえる神経堤とプラコードの形成機構について解析を進め、転写因子のカスケードではなく、細胞周期の状態を制御する事により神経堤とプラコードが形成されることを明らかにして来た(Nagatomo and Hashimoto, 2007, Murato and Hashimoto 2009) 。この考え方の主となる点は、神経板と表皮の運命が決まる時（ツメガエルでは初期原腸胚）において、神経と表皮の境界領域は運命決定がなされず、したがって多分化能を有した未分化な状態を維持する事により、神経堤やプラコード特有の能力（将来的に骨・神経節・間充織・色素細胞など多種多様な細胞へと分化する能力）を有する事ができ、その細胞内の状態がなければいかなる転写因子が存在しようとも下位のカスケードは動かず、結果として神経堤もプラコードも形成されないという事にある。 この点について異なる方向からの解析を進める為に初期神経胚の神経堤領域に発現する新規遺伝子P2Y4を見いだし、その初期発生における発現パターンを予備実験的に解析した。ヌクレオチド受容体をコードすると考えられるこの遺伝子は、神経胚の神経堤領域に一時的に発現が起こるが、将来的には神経堤に由来する組織での発現は見られず、現時点で推測されているこの遺伝子の働きとして、細胞の未分化性の維持に関わる事がいわれている為に、我々の仮説を支持する重要な分子の一つであるかもしれない。現在、この分子の機能獲得・機能喪失実験を行ない、神経堤とプラコードの形成にどのように関与するのか解析中である。

おわりに

　ここまで脊椎動物の体づくりの仕組みを、イモリとツメガエルを用いた解析の進捗状況として簡単に紹介した。今後は、イモリにおける遺伝子発現の解析や既知の遺伝子の働きを調べ、またツメガエルに実験発生学的方法論を駆使することで、イモリとツメガエルの本質的な相違点と相同点を見いだして行き、その中に神経堤やプラコードの形成機構に関する成果などを当てはめることにより、ゲノムが包含する「脊椎動物の形態」を進化的な視点も含めて考察して行きたい。

参考文献

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